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乳酸菌为主的发酵剂发酵中药在仔猪上的应用效果好

2019-07-25 22:58:37      点击:

化学合成类抗生素的推广应用带动了畜牧业的迅猛发展,极大地推动了规模化养殖的进程,使养殖成本不断降低。随着市场上肉、禽、蛋、奶供过于求,人们逐渐反思化学合成类药物饲料添加剂带来的健康、环境等负面影响。有实验证明长期使用或滥用抗菌素引发的耐药菌生长和抗药基因的转移,可能导致人和动物机体免疫力下降、二次用药增加、药物残留、双重和内源性感染等一系列问题,对健康构成威胁。而有机酸、酶制剂、益生元、植物提取物和精油、以及微生态制剂等新型饲料添加剂可能成为抗生素等药物饲料添加剂的替代品,从饲料源头消除安全隐患。

一、中药发酵

中药发酵是利用微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药的一种药物加工技术,其本质就是利用微生物在生长代谢过程中所产生的代谢产物(酶和有机酸等),对外源性中药底物进行结构的修饰和转化。

(一)中药发酵的历史

发酵作为传统中药炮制方法之一,应用已有一千多年的历史。它不但改变了煎、煮、熬、炼、蒸、浸等条件相对严苛的传统工艺,而且使药效提高、药性发生改变。经净制或处理后的药物,在相对温和的温度(30~37℃)和湿度(70%~80%)条件下,通过酵母、霉菌及酶等的作用,使药物发泡、生衣的方法称为发酵法。

(二)传统中药发酵的分类

1. 药料与面粉混合发酵

如神曲。神曲为青篙、杏仁等药加入面粉混合后,经发酵制成曲剂,有消食化积、健脾胃等功效。

2. 药料直接进行发酵

如红曲。红曲为红曲霉属真菌接种于蒸熟的大米上发酵而成,有健脾消食、活血化瘀的功效。

(三)传统中药发酵的优缺点

1. 优点

条件简单温和,原辅料多就地取材,真菌固体发酵为主,后处理烘干粉碎,易于保藏。

2. 缺点

(1)发酵菌种以真菌为主,相对单一,且自然条件下影响因素众多,目的菌接种与杂菌难以控制;

(2)发酵培养基影响很大,不同物料组成会产生药性药效的差异,导致适应证不同;

(3)发酵条件多凭经验感官把握,要想严格控制难度很大。主观性大,产品稳定性难以保证。

(四)现代中草药发酵的优点

1. 药物有效成分活性物质能最大限度地得以保留提取。

2. 严格发酵工艺控制,减少杂菌及有害产物的生成。

3. 产生新的有效活性物质,提升了药效。

4. 降低药物的毒副作用,改善适口性。

5. 提高利用价值,减少药材浪费,降低使用成本。

二、植物剂与微生态制剂的组合

(一)中药及益生菌拮抗产毒素大肠杆菌K88体外初筛试验

分别利用19种中药和8种益生菌进行药敏试验,结果显示其中5种中药及2种益生菌的抑菌效果较好,分别为乌梅、五倍子、党参、石榴皮、蒲公英、植物乳杆菌0015和嗜酸乳杆菌0111。并进一步选择中药乌梅、五倍子、党参、石榴皮、蒲公英及益生菌0015、0111作为后续动物体内筛选试验材料。

(二)中药及益生菌小鼠模型复筛试验

采用灌胃的方式给药,并测定给药小鼠的生理生化指标,来分析中药组方是否影响乳酸菌生长及乳酸菌发酵是否引起中药成分的变化。

1. 中药组方对乳酸菌生长的影响

通过发酵前后乳酸菌数量的变化分析,表明中药组方不影响乳酸菌生长。

2. 乳酸菌发酵对中药成分的影响

单味中药,如乌梅的有效成分主要是草酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸,蒲公英的有效成分主要是黄酮类(木犀草素、槲皮素)、酚酸类(绿原酸、咖啡酸、阿魏酸),五倍子的有效成分主要是鞣酸(单宁酸)和没食子酸,而嗜酸乳杆菌的有效成分主要是乳酸、乙酸和草酸等有机酸。

(1)乳酸菌发酵对蒲公英中绿原酸、木犀草素成分的影响

中药水提与中药发酵中的游离木犀草素、绿原酸含量相差不大,基本无影响,且重复性较好。表明乳酸菌发酵未改变蒲公英中有效成分木犀草素、绿原酸的含量。

(2)乳酸菌发酵对蒲公英中绿原酸成分的影响

中药水提和中药发酵中绿原酸含量相差不大。乳酸菌发酵未改变蒲公英有效成分绿原酸的含量。

(3)乳酸菌发酵对蒲公英中有机酸成分的影响

发酵后部分成分发生变化,除苹果酸含量有所降低外,各种有机酸均有不同程度的升高,其中柠檬酸和琥珀酸含量增加较多,分别为中药水提的1.28和2.51倍。

(3)乳酸菌发酵对蒲公英中新出现的成分的影响

五倍子水提液在20min左右出现了峰,发酵前出现的较高未知峰来源于五倍子。五倍子中含有丰富的单宁酸。以单宁酸为对照品,进行高效液相色谱分析,分析图谱可知,发酵前的未知峰为单宁酸。

随发酵时间延长,发酵前后未知峰此消彼长,7-9h变化较快,发酵12h后,发酵前峰降到最低,发酵后峰达到最高。说明发酵前后未知峰存在某种转化关系。五倍子主要成分为单宁酸和没食子酸,且两者之间存在转化关系。

乳酸菌0111在12h单宁酶活力也达到最高为758.76U/L。单宁酶活力的变化趋势与乳酸菌活菌数变化趋势基本相同。说明,嗜酸乳杆菌0111能够产生单宁酶,且单宁酶的活力与乳酸菌活菌数成正相关。从单独乳酸菌发酵液中检测不到单宁酶的酶活,说明在五倍子单宁存在条件下,可诱导该株乳酸菌产生单宁酶,而乳酸菌产生的酸性环境加快了单宁酸的水解转化。该菌已申报专利。没食子酸具有良好的消炎、杀菌、抗病毒等功效。新峰中其他具体成分仍在解析中。

三、中药乳酸菌发酵剂在仔猪上的应用

按照品种相同、胎次相近、体重相近的原则,选取21-28日龄断奶仔猪,共75头,分5个试验组,每组3个平行,每个平行5头。分别为空白对照组、乳酸菌组、中药发酵组、中药水提组、腹泻模型组,并检测其生长性能、腹泻率、免疫指标、肠道结构和通透性、肠道菌群等指标。

(一)对攻毒大肠杆菌K88仔猪生长性能的影响

攻毒大肠杆菌后,模型对照组平均日增重、平均日采食量与对照组相比显著下降,料重比显著升高,造模成功。各给药组与模型组相比,显著提高平均日增重、平均日采食量,显著降低料重比。发酵中药组与空白对照组相比,显著提高平均日增重、平均日采食量,显著降低料重比。发酵中药组料重比显著抵于中药水提组和乳酸菌组差异。中药发酵组对仔猪生长性能有较好的促进作用,能显著提高平均日增重、平均日采食量,降低料重比,效果最优。

(二)对攻毒大肠杆菌K88仔猪腹泻率的影响

中药发酵液能在较短时间内降低腹泻率,缩短病程,让腹泻仔猪恢复正常,效果:中药发酵组>乳酸菌组>中药水提组。

(三)对攻毒大肠杆菌K88仔猪体液免疫水平的影响

中药发酵液、中药水提液、乳酸菌菌液在攻毒大肠杆菌后,上调IgG水平,促进仔猪体液免疫,中药发酵组优于纯中药和乳酸菌组。

(四)对攻毒大肠杆菌K88仔猪形态学分析

模型对照组十二指肠、回肠、空肠绒毛稀松,较短,具有大量脱离上皮细胞碎片。空白对照组因断奶仔猪肠道发育不健全,也存在破损现象。中药发酵组和乳酸菌组,十二指肠、空肠、回肠绒毛排列紧密,较长,结构完整,无脱落和破损现象。

(五)对攻毒大肠杆菌K88仔猪小肠绒毛高度、隐窝深度的分析

十二指肠、空肠,尤其是回肠的高度和深度均是中药发酵组最好,乳酸菌组次之,总体而言,中药组相对会差一些,这可能与它的定位有关系。

(六)对攻毒大肠杆菌K88仔猪盲肠微生物OTU分析

1. venn diagram分析

OTU(operationaltaxonomic units),即操作分类单元。即相似性聚类分析,用以表现菌群丰度。试验共获得353 个不同OTU,其中五组样品共有的OTU数是142个;TCML组中共有 248 个OUT,5个特有OUT;LAC组中共有263 个OTU,18个特有OUT;NC组中共有242个OTU,8个特有OUT;FTCM组中共有264个OUT,25个特有OTU。说明仔猪饲喂中药发酵物后,特异性OUT数量增加,菌群种类丰富。

2. 等级曲线分析

模型PC组盲肠内微生物的OTU等级曲线坡度最大且横坐标范围最小。FTCM(中药发酵组)等级曲线最平稳且横坐标范围最大,说明仔猪盲肠中微生物物种分布较均匀,其次是LAC组和TCML组。说明,给药后,仔猪盲肠中微生物物种增多且分布均匀。

3. 统计分类学分析

不同组别盲肠内容物微生物在门水平下分类(Phylum)优势菌群为后壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)。在属水平上,盲肠微生物主要有乳酸杆菌属(Lactobacillus)、Subdoligranulum、链球菌属(Streptococcus )、Catenisphaera、拟杆菌属(Bacteroides)、Terrisporobacter和Olsenella等,但各处理组之间的差异较大。与NC和PC相比,三个给药组(FTCM、TCML和LAC)均增加了乳酸菌Lactobacillus比例,且差异显著(P<0.05),其中以LAC组含量最高。NC和PC链球菌属(Streptococcus )的含量分别为3.41%和15.49%,与各给药组差异显著。

FTCM:发酵中药;NC:空白对照组;PC:模型对照组;TCML:中药水提组;LAC:乳酸菌发酵液组

(七)对攻毒大肠杆菌K88仔猪盲肠内容物细菌16S rRNA α多样性分析

攻毒试验组(PC)Chao指数、Ace指数、Shannon指数均降低,Simpson指数增高。说明攻毒后,仔猪盲肠内容物细菌多样性受到影响。发酵中药能显著改善仔猪盲肠内容物细菌多样性,让肠道菌群微生物区系更稳固。各处理组的平均覆盖率均在98.0%以上,说明样品的测序数量已完全能够反映仔猪盲肠内容物中的菌群情况。

四、结语

中药发酵将传统的中药理论和现代生物工程技术有机结合,值得深入研究。中药发酵是中药迈上现代化的必经之路,强化中药资源的有效利用,在动物医学上意义尤其重大。但对于方剂和菌种,应该根据畜禽需要,进行审慎的选择和科学评价,切忌想当然和主观臆断。而发酵工艺、关键点控制等应规范化、标准化,保证产品稳定性与可靠性。此外,应密切关注发酵过程中相关成分的变化,避害趋利。

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