菌渣废弃物一般富含水分、易腐烂、不易保存，直接排放污染环境。随着经济的快速发展和人们生活水平日益提高，畜牧产品需求增大，致使饲料缺口逐年增加，出现了供求关系难以平衡的局面。因而，寻求新蛋白源成为饲料科学中的一项重要课题。目前，运用微生物发酵生产蛋白饲料越来越受重视。本研究探讨不同基质配比、不同温度、不同料水比以及不同培养时间对酵母菌发酵蛋白质含量的影响，并在单因素试验的基础上，采用正交试验法对菌渣固态发酵菌体蛋白饲料的工艺进行优化。

1.1　材料

酵母菌、提取金顶侧耳菌菇多糖后残留菌渣、麸皮、马铃薯浸取液、葡萄糖、琼脂粉、玉米粉、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、40％ NaOH 溶液、HCI 溶液、混合滴指示剂（0.１％ 甲烯蓝∶0.1％ 甲基红＝1：4）。

1.2　方法

1.2.1 　基础培养基的制备　

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：自制马铃薯浸取液1.0 Ｌ，加入琼脂粉15.0 g，葡萄糖20.0 g，121 ℃灭菌25 min 后，取出斜面放置，冷却备用。

固态发酵培养基：分别以菌渣、菌渣＋麸皮、菌渣＋玉米粉为培养基基质，添加一定量的水分、配制成用于考察水料质量比（简称水料比）、发酵温度、发酵时间对发酵产物蛋白含量影响的不同培养基，于121 ℃灭菌25min 。

1.2.2 　菌种的活化

在无菌条件下，将酵母菌种接种到PDA 斜面培养基上，放置恒温箱内，在30 ℃下恒温培养，活化72ｈ，得到优质菌种。

1.2.3　液体种子培养

在无菌条件下，用10mL 无菌水冲洗斜面培养基上已活化的菌种，接种至盛有80mL 液体种子培养基的三角烧瓶中，置于摇床中，在30℃、160r/min的条件下振荡培养72h。

1.2.4　固体发酵培养　

在无菌条件下，将酵母菌以13％ 的接种量接种到已灭菌的固体发酵培养基中，置于25 ～40 ℃恒温箱中培养72ｈ。待培养结束后，将培养物置于50 ℃烘箱中风干，测粗蛋白质含量。基础对照为未发酵样品，将试验所用的金顶侧耳菌菇多糖提取后的残渣在50 ℃条件下烘干，随机称取0.2g 未经酵母菌发酵样品，测定其蛋白质含量。

1.2.5　粗蛋白质含量的测定　

采用微量凯氏定氮法测定粗蛋白质含量。将发酵好的培养基烘干至恒质量，称取0.2g烘干后的培养基，放入干燥的消化管中，再加入0.4g 的混合催化剂后，加入20mL的浓硫酸。待消化管中液体冷却后，加入蒸馏水20mL进行蒸馏，在接收瓶中加入2％ H₃ BO₃ 50 ｍＬ和2 ～3 滴指示剂，用0.05 mol/Ｌ HCI 滴定接收瓶内的溶液，滴定溶液由绿色变成淡紫色或灰色时为滴定终点，记下消耗HCI 的体积（mL），计算粗蛋白质含量。

1.2.6 　正交试验设计

在单因素试验的基础上，采用L₉(3⁴)正交试验法对基质配比、温度、水料比以及培养时间这4 个影响因素进行优化，每组试验重复3 次。

2结果与分析

本研究探讨了不同基质配比、不同温度、不同水料比以及不同培养时间对酵母菌发酵蛋白质含量的影响，并在单因素试验的基础上，采用L₉(3⁴)正交试验法对基质配比、温度、水料比以及培养时间4 个因素进行优化。

2.1　不同基质配比对粗蛋白含量的影响

优化后的蛋白含量显著高于未发酵样品的蛋白含量（7.8%）。在1mL∶2.5g的水料比、13％ 接种量、30 ℃培养96h条件下，不同基质配比所获蛋白质含量呈现显著差异。当菌渣与麸皮以质量比9：1 的比例混合时，粗蛋白质含量可达最高值（18.3％），与纯菌渣组和质量比9：1 菌渣玉米粉组呈现显著差异。这可能是因为在培养基的发酵体系中，麸皮含有较丰富的营养组分，其所含糖分、蛋白质、维生素和矿物质等都是菌种发酵所必需的物质。因此，添加麸皮有利于菌体生长。同时，麸皮质地粗糙，能增强物料通透性，促进菌生长。添加玉米粉的培养基，粗蛋白质含量增加不明显，仅为12.1％，这可能是由于玉米粉颗粒较细，易使培养基黏性大、结块、通透性差，从而不利于菌体生长。

2.2　不同温度对粗蛋白含量的影响

在1mL：2.5g的水料比、13％接种量、菌渣和麸皮质量比9：1、培养96h 的条件下，不同温度下所获蛋白质含量呈显著差异。蛋白质含量随温度升高而增加，当温度为30℃ 时，蛋白质含量达最高值，30℃也是酵母菌体较为适宜的生长温度。当温度升至35℃时，蛋白质含量开始随温度升高而降低，这可能是由于温度过高，加快了发酵物的水分蒸发，造成了不利于菌体生长的环境，从而降低蛋白质含量。

2.3　不同水料比对粗蛋白含量的影响

菌体的生长需要适宜的水分，固态发酵物料中的含水量是影响蛋白质产量的重要因素之一。在菌渣和麸皮质量比9：1、13％接种量、30℃培养96h 条件下，不同水料比会使蛋白质含量呈显著现差异。水料比为1mL∶1.0g 时，粗蛋白含量最低，仅有10.8％；当水料比为1mL：2.5g时，粗蛋白质含量高达:17.7％；当水料比为1mL∶3.0g 时，粗蛋白量降低至15.3％。基质水分过多，培养基易黏结，多孔性降低，通透性削弱，基质易变质，杂菌易污染；含水量过低，则会降低培养基的膨胀程度，妨碍菌体利用基质营养，从而影响菌体生长，导致菌体生长不完全，蛋白质含量低。

2.4　不同发酵时间对粗蛋白含量的影响

在1mL ∶2.5g 的水料比、菌渣和麸皮质量比9：1、13％接种量、30℃培养条件下，不同发酵时间下蛋白质含量呈现显著差异。发酵初始，粗蛋白含量随时间增加而增长，当发酵96ｈ 时粗蛋白含量高达17.6％；随着发酵时间延长至120ｈ，蛋白质含量降低至15.7％。由此可见，当发酵24ｈ 时，菌体没有达到完全生长，随着时间的延续，菌体逐渐成熟。在发酵96h 时，菌体生长最佳。发酵120ｈ 后，菌体有可能已经完成了生长周期，表现出衰退或死亡的现象，并引起菌体的自溶现象，从而降低粗蛋白含量。

2.5　固态发酵条件的正交优化

在单因素试验的基础上，采用L₉(3⁴)正交试验法对基质配比、温度、水料比以及培养时间这4个影响因素进行优化，结果见表2。极差分析结果显示，影响粗蛋白含量影响因素主次顺序分别为基质配比＞发酵时间＞温度＞水料比；方差分析结果也显示，基质配比是影响粗蛋白含量的主要因素。固体发酵菌渣蛋白饲料工艺中的最优组合为A₃ B₂ C₁ D₃ ，即在酵母菌接种量1％条件下，菌渣∶麸皮质量比为8：2、水料比1 mL：2.5g、30℃下培养96h，发酵物的粗蛋白含量可达18.43％。