摘要：试验研究复方中草药发酵前后成分变化，为新型绿色饲料添加剂的研制提供参考。在单因素试验设计基础上，通过4因素3水平正交试验设计对枯草芽孢杆菌发酵复方中草药的条件进行优化。在紫外分光光度计625nm下检测发酵前后复方中草药多糖变化。试验最终确定复方中草药的最佳发酵工艺为料水比1􀏑0.5，接菌量4%，时间48 h，温度37 ℃，含糖量得到显著提高。

关键词：饲料添加剂；复方中草药；枯草芽孢杆菌；多糖含量

目前，我国畜禽养殖业抗生素滥用现象相当严重[1]。虽然抗生素在提高生产效益上发挥了一定的积极作用，但其所导致的负面效应也越来越引起人们的关注。2006年1月1日，欧盟全面禁止抗生素作为饲料添加剂在畜禽养殖中的使用。面对世界各国逐步禁用抗生素饲料添加剂的趋势，我国对绿色饲用抗生素替代品的需求亟待解决[2]。发酵炮制中草药有着独特的优势。本研究选用马齿苋、黄芪、党参、麦芽、木香等中草药按比例制成复方，用单因素和正交试验相结合的试验设计最终确定其最佳的发酵工艺，其中，发酵微生物为枯草芽孢杆菌，以复方中草药发酵前后多糖含量变化为检测指标，为饲用抗生素替代品的研制提供参考。

1· 材料与方法

1.1 试验材料 菌种:枯草芽孢杆菌(购于保定瑞谷科技有限公司)。试验原料：中草药（均购自哈尔滨药材市场）、酵母膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、浓硫酸、盐酸、蒽酮及其他试剂均为分析纯（购自哈尔滨化学试剂公司）。

仪器：超净工作台（DL-CJ-ZND北京东联哈尔一起制造公司）。

紫外分光光度计：SHIMADZUUV-2401PC。电热恒温培养箱（福玛GHX-9880B-1）；高压灭菌锅（MLS-3020）。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

将样品葡萄糖在105 ℃烘箱中烘至恒重，使用分析天平称取0.010 g于100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，得到葡萄糖标准溶液。移液枪分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml 葡萄糖标准溶液至干净具塞试管内，加蒸馏水至1 ml。各试管加入硫酸蒽铜溶液（0.1 g蒽酮溶于100 ml 80%浓硫酸中）4 ml，沸水中加热10 min，冷却至室温。

分光光度计在625 nm测其吸光度。对所得值进行线性回归，得到回归方程：y=83.93x+0.011，R2=0.998。

1.2.2 含糖量的测定

中草药在烘箱中烘干后，粉碎，过60目筛，按比例配成27.5 g放入250ml三角瓶中用玻璃棒搅拌均匀，在无菌操作台中紫外照射30 min。取三角瓶中中草药粉末0.5 g放入250 ml三角瓶中，加入45ml 80%乙醇浸泡30 min，超声30 min，用加有滤纸的漏斗过滤弃去滤液。过滤后中草药残渣再次放入250 ml三角瓶中，重复上述操作1次。将滤渣放入烘箱中烘干，加入2%盐酸，沸水浴1 h，冷却至室温后过滤到100 ml容量瓶中，重复操作1次，合并滤液，用2%盐酸定容。混匀，取1 ml中草药提取液于25 ml容量瓶中，用2%盐酸定容，取1ml于具塞试管中，加入4 ml硫酸蒽酮溶液，沸水浴10min,凉水冷却至室温，分光光度计625 nm下测定吸光度。得到未发酵复方中草药含糖量为10.05%。

1.2.3 菌种的活化

取适量菌粉于灭菌生理盐水中，在无菌操作台里浸泡24 h后，接种到装有枯草芽孢杆菌液体培养基的三角瓶里。放置到电热恒温震荡培养箱，37 ℃，培养48 h。培养两代后，对枯草芽孢杆菌进行平板计数，比较该菌正常活菌数（30亿/g），来决定复壮次数。

1.2.4 复方中草药的发酵

5种中草药进行粉碎后过60目筛。取复方中草药粉末27.5 g入250 ml三角瓶，在无菌操作台中紫外灭菌30 min，按比例加入菌液、灭菌蒸馏水，用封口膜封好，在设定温度下培养，筛选最适接菌量、料水比、时间、温度，再进行正交试验。

1.2.5 料水比对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每组3个重复。料水比分别为1􀏑0.5，1􀏑0.6，1􀏑0.7，1􀏑0.8，1􀏑0.9，1􀏑1，接菌量4%，培养时间72 h，培养温度37 ℃，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60 目筛后每份取0.5 g 样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳料水比。

1.2.6 接菌量对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每组3个重复。接菌量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%，料水比由1.2.5节确定，培养时间72 h，培养温度37 ℃，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5 g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵接菌量。

1.2.7 培养时间对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每组3 个重复。发酵时间分别为24、48、72、96、120、144 h，料水比由1.2.5节确定，接菌量由1.2.6节确定，培养温度37 ℃，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5 g样品如1.2.2方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵时间。

1.2.8 培养温度对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每组3个重复。培养温度为分别为29、31、33、35、37、39 ℃，料水比由1.2.5节确定，接菌量由1.2.6节确定，时间由1.2.7节确定，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5 g样品如1.2.2节方法测定发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵温度。

1.2.9 正交试验优化复方中草药的发酵条件

在单因素试验条件下确定适合复方中草药发酵接菌量、料水比、温度、时间的最适值，在此基础上进行四因素三水平的正交试验，发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5 g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵方案。

1.3 数据处理

试验所得数据用SPSS19.0进行分析。

2· 结果与分析

2.1 料水比对复方中草药发酵的影响

不同料水比对复方中草药发酵的影响如图1所示。由图1可知，料水比为1：0.5，1：0.6时，药物发酵后多糖含量逐渐增加，料水比1：0.6时多糖含量最高，之后多糖含量随着水分的增加而减少，料水比为1：1时，发酵药物多糖含量下降幅度较大。单因素条件下1：0.6为药物发酵最佳料水比。

2.2 接菌量对复方中草药发酵的影响

不同接菌量对复方中草药发酵的影响如图2所示。由图2可知，接菌量为2%、4%、6%时发酵后药物多糖含量逐渐升高，接菌量为6%、8%、10%、12%时发酵后药物多糖含量逐渐降低。在单因素条件下6%为药物发酵最佳接菌量。

2.3 时间对复方中草药发酵的影响

不同时间对复方中草药发酵的影响如图3 所示。由图3可知，培养时间在24~48h范围内，发酵药物多糖含量快速上升，培养时间在48~144 h范围内，发酵药物多糖含量逐渐降低。单因素条件下48 h为药物发酵最佳时间。

2.4 温度对复方中草药发酵的影响

不同温度对复方中草药发酵的影响见图4。由图可知，温度在29~35 ℃范围内，发酵药物多糖含量逐渐升高，35~39 ℃范围内药物多糖含量逐渐下降。单因素条件下，35 ℃为药物发酵最佳温度。

2.5 正交试验优化复方中草药的发酵条件

由单因素试验确定正交试验各因素的水平值，如表1，正交试验操作表如表2，方差分析结果如表3。

由表2、表3可知，4个因素对发酵后复方中草药多糖含量影响的主次顺序为：D（温度）>C（时间）>A（料水比）>B（接菌量），可知发酵工艺条件最佳组合为A1B1C2D3。方差分析结果表明D(温度)、C（时间）对发酵试验结果的影响极显著(P<0.01)，A（料水比）对发酵试验结果影响显著(P<0.05)，B(接菌量）的影响不显著（P>0.05）。发酵复方中草药（马齿苋、黄芪、党参、麦芽、木香）的最佳工艺组合为：料水比1􀏑0.5，接菌量4%，时间48 h，温度37 ℃。此条件下发酵的复方中草药多糖含量为17.98%。

3 ·讨论

微生物在发酵中草药的过程中，产生的酶类可以消化植物细胞壁，释放活性物质[3-4]，降解有毒物质，产生新物质[5-6]。国家科技部已将中药发酵工程列入“十五发展计划”[7]，中草药发酵技术具有广阔的发展前景。

在发酵过程中，培养温度是影响微生物生长的最重要因素之一[8]。参与细胞内生化反应酶的活性与温度息息相关。当培养温度低于微生物最佳生长温度时，其生长速率大于死亡速率，降解中草药基质产生较多的多糖，培养温度高于最佳温度时，微生物生长速率小于死亡速率，其他适宜杂菌的生长加快，枯草芽孢杆菌不再是优势菌群，杂菌利用了基质中的多糖，降低基质中多糖含量。固体发酵时，随着微生物的生长，会产生大量的热，引起物料温度的变化，一般情况下，固态发酵物料在一定温度范围内波动。由于试验发酵所用物料很少（27.5 g），培养箱恒温控制，可忽略发酵物料温度的波动。但大规模发酵时，由于物料热传导性差，固态基质内部温度变化大，直接影响菌群生长，所以要控制好发酵温度，具体措施有待研究。

微生物发酵都有一个最佳时间阶段[9]。在发酵过程中，产物的浓度是变化的，一般产物高峰生产阶段时间越长，生产率也越高，但到一定时间产物产量会减缓，甚至下降。所以发酵时间不是越长越好。

水是细胞生命活动的内环境，物料含水量的变化会影响微生物的生长及代谢[10]。基质底物的含水率,必然影响发酵结果。微生物在固态基质上的生长取决于水活度(aw），水活度与培养基中水分含量有关，两者的关系与温度及物料性质有关，不是正比关系，但具体关系目前还没有研究。每种微生物有属于自己的最适aw。aw 值太低，微生物生长缓慢，甚至死亡。

随着含水量的升高，导致基质中氧的传质阻力升高，多孔性降低，减少了O2的供给，影响了枯草芽孢杆菌的生长，增加了污染杂菌的危险，以致杂菌消耗基质中的多糖，使多糖含量低于未发酵基质。在固态发酵基质中,水含量应控制在既能供微生物大量生长又低于杂菌生长所需要的程度,一般的固态发酵湿基含水量在50%左右[11]。

人工接种的微生物具有生长优势，培养基中接入合适的菌量能缩短菌体的停滞期，使菌体生长快速进入生长对数期，进而缩短发酵周期；但是不适合的接种量可能使菌体处于停滞期的时间加长，菌体生长缓慢，其他杂菌趁机生长，影响基质的正常发酵。本研究结果显示接菌量数值在一定范围内浮动对发酵结果无显著影响。

我国固态发酵技术历史悠久，现代固态发酵工程在发酵工艺上进行了多方面的技术改进。固态发酵有着能耗低，产率高，污染小，后处理加工方便等优点。本试验利用固态发酵复方中草药的方法来研制新型饲料添加剂，为替代饲用抗生素提供一定的参考。

4· 结论

发酵复方中草药（马齿苋、黄芪、党参、麦芽、木香）的最佳工艺组合为：料水比1􀏑0.5，接菌量4%，时间48 h，温度37 ℃。此条件下发酵复方中草药提高多糖含量效果明显。

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