1.1 试验菌种

芽孢杆菌:枯草芽孢杆菌BI1、枯草芽孢杆菌B10-5;产乳酸菌:凝结芽孢杆菌、发酵乳杆菌, 均由本实验室保藏。

1.2 木薯渣固体发酵饲料配方

木薯渣70%、玉米淀粉渣20%、玉米皮10%。

1.3 培养方法

1.3.1 培养基

LB培养基:胰蛋白胨10 g/L, 酵母浸出粉5 g/L, NaCl 10 g/L, pH值7.2。

肉汤培养基:牛肉膏5 g/L, 蛋白胨10 g/L, NaCl5 g/L, p H值7.2~7.4。

淀粉培养基:牛肉膏5 g/L, 蛋白胨5 g/L, NaCl 5 g/L, 可溶性淀粉20 g/L, 琼脂18 g/L, pH值7.2。

MRS培养基:蛋白胨10 g/L, 牛肉膏10 g/L, 酵母浸出粉5 g/L, 葡萄糖5 g/L, CH₃COONa 5 g/L, 柠檬酸二胺2 g/L, 吐温-80 1 g/L, K₂HPO₄ 2 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L, MnSO₄·7H₂O 0.05 g/L, CaCO₃ 20 g/L, pH值6.2。

麦康凯琼脂培养基:蛋白胨20 g/L, 乳糖10 g/L, 牛胆盐5 g/L, NaCl 5 g/L, 中性红0.03 g/L, 琼脂18 g/L, pH值7.0。

1.3.2 芽孢杆菌种子液制备

从LB培养基斜面上挑取1环菌, 接入到装有50 ml肉汤培养基的250 ml三角瓶中, 放置于温度37℃、转速200 r/min的摇床中振荡培养12 h。

1.3.3 产乳酸菌种子液制备

从MRS液体培养基中吸取1 ml培养液, 接入到装有50 ml MRS液体培养基的250 ml广口瓶中, 放置于温度37℃的恒温培养箱中静置培养20 h。

1.3.4 木薯渣固态发酵饲料

将枯草芽孢杆菌BI1、枯草芽孢杆菌B10-5、凝结芽孢杆菌、发酵乳杆菌菌液按比例与一定量的水混合, 然后与木薯渣饲料混匀, 装入发酵袋中培养。

1.3.5 乳酸含量的测定

准确称取发酵饲料5.00 g置于装有50 ml蒸馏水的250 ml的三角瓶里, 充分摇匀并浸提1 h, 之后离心取上清液, 稀释相应倍数后用生物传感分析仪测定其中的乳酸含量。

1.3.6 活菌数的测定

芽孢杆菌用可溶性淀粉固体培养基作为计数培养基;产乳酸菌用MRS固体培养基作为计数培养基;大肠杆菌用麦康凯固体培养基作为计数培养基。

1.4 发酵条件的单因素优化

1.4.1 两株芽孢杆菌混合比例的确定

选取两株芽孢杆菌比例为3：1、2：1、1：1、1：2、1：3这5个水平进行分析。

1.4.2 两株产乳酸菌混合比例的确定

选取两株产乳酸菌比例为3：1、2：1、1：1、1：2、1：3这5个水平进行分析。

1.4.3 芽孢杆菌与产乳酸菌混合比例的确定

选取芽孢杆菌与产乳酸菌比例为1：2、2：1、1：1、3：1、3：2这5个水平进行分析。

1.4.4 总接种量的确定

选取接种量为1%、3%、5%、7%、9%这5个水平进行分析。

1.5 发酵温度的确定

选取温度为22、27、32、37、42℃这5个水平进行分析。

1.6 发酵条件的正交试验

在单因素试验的基础上, 选取影响显著的因素进行正交试验。采用L₉ (3³) 型三水平三因素正交表, 以芽孢菌与乳酸菌的接种比例、接种量、发酵温度3个因素作为考察因素, 研究对发酵结果的影响。

1.7 育肥猪饲喂试验

1.7.1 试验动物和分组

将120日龄60头70 kg左右的健康的“杜×大×长”三元杂交生长肥育猪随机分成4组, 每组3个重复, 每个重复5头猪。

1.7.2 试验日粮与设计

试验设4个处理组, 即对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组, 分别饲喂0、5%、15%、25%不同比例木薯渣发酵饲料的基础日粮 (见表1) 。基础日粮营养水平参照NRC (2012) 推荐量平衡日粮中的能量和各种营养物质。

1.7.3 饲养管理

进猪前要检查维修圈舍设备, 并清扫圈舍, 然后用2%火碱水溶液或其它消毒药消毒。按猪的体重、体质强弱等相近的原则分4组, 每组3个重复, 每个重复5头。进入猪舍后, 舍内温度控制在16~21℃之间, 相对湿度50%~70%之间, 保持空气流通。自由采食, 自由饮水, 采用全自动饮水装置, 预试期为3 d, 正试期为30 d, 每天清扫圈舍和除粪2次, 保证猪舍内环境卫生良好, 每周舍内通道用2%火碱溶液或其它消毒药消毒1次。平时经常观察猪群采食、排粪情况、健康状况和精神状态, 发现疫病及时隔离治疗。每周统计试验猪采食量和增重, 及时检测试验猪粪便中的微生物。

1.7.4 测定指标

生长性能指标:分别于试验的开始和结束对所有试验猪进行空腹称重, 根据每个圈舍试验猪的总重量和头数来计算平均头重, 再根据平均头重的初重和末重来计算出平均日增重。每周要记录各组试验猪的采食量, 试验结束后结算各组试验猪消耗饲料的总重, 计算出平均日采食量。根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。

粪便中微生物的测定:分别在试验第15 d和第30 d时, 即整个试验时期的中期和末期, 进行猪粪便中微生物的测定, 分别取每组试验猪1 h内的新鲜猪粪, 并尽量取多只猪的粪便, 然后混匀, 准确称取粪便5 g置于装有生理盐水的三角瓶中, 瓶内预置适当数量的玻璃珠, 震荡15 min, 使粪便中的微生物悬浮于生理盐水中, 然后用十倍稀释法进行稀释, 选取合适的稀释梯度进行涂布计数。乳酸菌用MRS培养基作为计数培养基, 大肠杆菌用麦康凯培养基作为计数培养基。

1.8 数据处理

采用SPSS 16.0统计分析软件进行分析。

2.1 木薯渣发酵饲料两株枯草芽孢杆菌混合比例的优化 (见表2) 

表2 两株芽孢菌混合比例对木薯渣发酵饲料的影响 下载原表 

从表2可以看出, 两株枯草芽孢杆菌的比例对乳酸含量和活菌总数都有影响, 但影响都较小, 比例为1：2时, 活菌总数有较高水平, 乳酸含量也最高, 从而确定木薯渣发酵饲料中两株枯草芽孢杆菌BI1和B10-5的比例为1：2。

通过对各组猪粪中大肠杆菌数、乳酸菌数以及芽孢杆菌数的测定, 从表11可以看出, 试验Ⅱ组乳酸菌数最高, 芽孢杆菌数也有较高水平, 但四组之间没有显著差异。饲料经过发酵后, 猪采食后未能改善猪肠道内微生物环境, 也可能与饲喂时间短有关。