家禽发酵饲料乳酸菌菌株的筛选

2018-08-27 14:42:36      点击:

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导读

畜牧生产中抗生素的广泛使用造成了大量耐药菌的产生,严重威胁了人类的生物安全。因此,研究人员致力于寻找抗生素可能的替代品来改善饲养过程中动物的健康和生产性能,其中包括有机酸、中性脂肪酸、益生素、益生菌、酵母细胞壁、植物提取物、发酵饲料、酶和免疫增强剂等。发酵饲料既含有益生菌菌体,又含有丰富的益生菌发酵产物,是目前饲料研究的热点。发酵饲料是在营养均衡全面的无抗生素全价配合饲料中加入益生菌和水,混合后在适当的温度下经厌氧或好氧发酵而成的饲料。研究结果表明,肉鸡饲喂发酵饲料能够显著提高其生产性能和减少肠道病原菌数量。许多病原菌,如大肠杆菌和沙门氏菌不能在pH值小于4.5的条件下存活或生长,因此pH值是评判发酵饲料的一个重要指标。目前发酵饲料多采用混合乳酸菌对饲料进行短期发酵,为了有效地降低病原菌的数量,快速诱导乳酸的产生最终形成低的pH值在饲料发酵过程中就显得尤为重要。R.L.VanWinsen等研究指出,乳酸含量是发酵饲料抑菌的重要因素,因此发酵所用的菌株应具有高效的产乳酸的能力,才能有效地抑制病原菌。A.J.VanDijk等研究结果表明,一种好的发酵饲料应具备以下四种基本特征:1)pH值≤4.5;2)乳酸菌含量>1x109cfu/mL;3)乳酸含量>150mmol/L;4)乙酸和乙醇含量<40mmol/L和0.5mmol/L。本试验通过对不同来源的乳酸菌菌株种属进行鉴定和产酸能力测定,旨在筛选出适合家禽发酵饲料用的乳酸菌菌株。

1材料与方法

1.1 主要试剂

MRS培养基( M8330) 、甘油( G8190) ,北京某公司生产; 细菌DNA 提取试剂盒( D3350-01) ,美国某公司生产; 葡萄糖、麦芽糖等常规生化试剂,均购自陕西某公司。


1.2 主要仪器

pH 计( 型号为FE20) ; 分光光度计( 型号为LAMBDA-25) ; 高效液相色谱仪( 型号为1260) ; 生化培养箱( 型号为SNP-250) ; 超净工作台( 型号为SW-CG-1FD) 。


1.3 乳酸菌的分离

选择健康成年散养鸡,颈部放血致死,立刻无菌采集回肠和盲肠内容物。称量10 g 肠道内容物,加入90 mL 无菌磷酸盐缓冲液( PBS) ,涡旋振荡5 min,按照10 倍梯度稀释逐级稀释( 1×10-2 ~ 1×10-6 ) ,然后各取100 μL 均匀涂布于MRS平板中,常氧条件下37 ℃倒置培养48 h。挑取无明显菌落黏连、融钙圈明显、菌落形态和颜色不同的单菌落接种于MRS液体培养基中,划线纯化2 次。纯化菌株与30%灭菌甘油按1 ∶1混合后-80 ℃保存,备用。


1.4 乳酸菌的鉴定

备选菌株37 ℃培养18 h,离心收集菌体后利用OMEGA 细菌DNA 提取试剂盒提取菌体DNA。以菌体DNA 为模板,以16S rRNA 通用引物27F ( 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3') 和1 492R ( 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 进行16s rRNA 片段的扩增,扩增产物测序,测序结果通过NCBI 在线进行BLAST 比对,确定菌株的种属。


1.5 产酸能力测定

备选菌株37 ℃培养48 h,将100 μL 培养液加入10 mL 改进的MRS 培养液中( 不加乙酸钠和葡萄糖,但加入35 g /L 麦芽糖、5 g /L 果糖和0.01 g /L 溴酚蓝) , 37 ℃培养,连续观察4 d,以溴酚蓝作为酸碱指示剂记录培养液颜色变化时的培养时间。在培养90 h以后利用pH 计测定培养液pH 值。为了进一步测定最大产酸量,将100 μL 培养液加入10 mL 改进的MRS培养液( 加入2%的CaCO3) 中37 ℃ 培养48 h,利用高效液相色谱测定培养液中的乳酸和乙酸含量。


1.6 抑菌试验

参照李龙等方法进行。将备选菌株按照1%接种于5 mL 的MRS液体培养基中, 37 ℃培养24 h,4 ℃保存,备用。配制固体LB 培养基( 蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,琼脂15 g,加入纯化水定容至1 000 mL) ,每个平板倒入20 mL LB 固体培养基,冷却,加入过夜培养的病原菌( 大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌) 培养液100 μL,均匀涂布于平板表面,平板干燥后等距离放入4 个牛津杯,每个牛津杯中加入200 μL 待测菌液,37 ℃静置培养24 h,利用游标卡尺测定抑菌圈直径( mm) 。每个菌株测定3 个重复,以不接种菌液的MRS液体培养基作为阴性对照。


1.7 表面疏水性和耐酸、耐胆盐性

菌株表面疏水性参照D. Bujnakova 等的方法进行。菌株耐酸、耐胆盐性参照N. Azami 等的方法进行。利用96 孔微孔板,分别加入200 μL MRS液体培养基( pH 值= 6.3) ,200 μL pH 值为2.5 的MRS液体培养基, 200 μL MRS液体培养基和200 μL含2%牛胆汁的MRS液体培养基( pH 值= 6.3) ,每孔加入1×106cfu 的待测菌株,每个菌株重复3 次,培养24 h 后通过平板计数和在600 nm 处测定吸光度检测活菌数量和菌株生长情况。


1.8 发酵饲料制备和细菌计数

参照NRC( 1997) 饲养标准配制肉鸡饲养前期( 0~21 d) 饲料配方,基础日粮中无抗生素添加( 试验基础日粮组成及营养水平见表1) 。以备选菌株作为发酵菌种,发酵菌株的添加量为1×107cfu /kg,料水比为1 ∶1.5,密闭于饲料发酵袋中, 37 ℃培养72 h,每个菌株做3 个重复。分别在0,8,24, 48, 72 小时取样测定发酵饲料pH 值、乳酸菌数量和乙酸、乳酸含量。发酵饲料pH 值测定参照刘晓明的方法进行,乳酸菌计数采用MRS平板计数法,乳酸和乙酸含量利用高效液相色谱法进行测定。

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1.9 数据的统计与分析

采用SPSS 17.0 对数据进行统计分析,采用One-Way ANOVA 进行方差分析,LSD 法进行多重比较,试验结果以“平均值±标准差”表示。

2结果与分析

2.1 乳酸菌的分离与鉴定

通过形态和分子生物学鉴定,试验共从肉鸡胃肠道中分离得到98 株乳酸菌菌株,依次编号为FJ-1 至FJ- 98,其中唾液乳杆菌( Lactobacillus salivarius )19 株,罗伊乳杆菌( Lactobacillus reuteri) 17 株,约氏乳杆菌( Lactobacillus johnsonii) 14 株,植物乳杆菌( Lactobacillusplantarum) 9 株,干酪乳杆菌( Lactobacillusreuteri) 7 株,粪肠球菌( Enterococcus faecium) 20 株,屎肠球菌( Enterococcus faecium) 12 株。


2.2 产酸能力测定

通过对98株分离乳酸菌菌株产酸能力测定发现,不同的菌株产酸能力差异很大,指示剂变色时间范围从17h(FJ-66)到88h(FJ-33),乳酸的产量范围从18mmol/L(FJ-22)到269mmol/L(FJ-38),依据各菌株的产酸速度和乳酸浓度的高低,最终选出8株产酸特性好的乳酸菌菌株进行后续试验。8株乳酸菌菌株产酸特性测定结果见表2。

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2.3 表面疏水性和抑菌效果4.jpg

通过对8株备选菌株疏水性测定发现,菌株之间表面疏水性差异很大,其中FJ-38菌株疏水性最高,达到97.11%,而FJ-11菌株疏水力最低,只有1.23%。另外,8株备选菌株对病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和巴氏杆菌都展现出了良好的抑菌效果,同时试验还选择了乳酸产量较低的FJ-8(98mmol/L)菌株进行抑菌试验,结果发现其抑菌活性显著低于上述8株备选菌株,说明乳酸的产量与抑菌活性存在一定的相关性。


2.4 耐酸、耐胆盐性

结果见表4。

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由表4可知:在低pH值条件下(pH值=2.5)不同菌株存活能力差异巨大,其中FJ-11、FJ-52和FJ-66菌株存活率均低于10%;而FJ-38和FJ-92菌株表现出了良好的耐酸特性;除FJ-11菌株外,所有菌种在2%牛胆汁条件下都表现出了良好的生长特性和存活率。


2.5 发酵试验

结合之前的试验结果发现,FJ-38、FJ-54、FJ-67、FJ-85和FJ-92表现出了良好的耐酸、耐胆盐特性和表面疏水性,因此选择这5个菌株进行饲料发酵试验。结果见表5。

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由表5可知:在发酵前饲料的pH值为6.2,37℃发酵24小时菌株发酵组的pH值均降低,其中FJ-38和FJ-92较低,并且显著低于对照组(P<0.05);发酵72小时所有菌株发酵组pH值均显著低于对照组(P<0.05),其中FJ-38和FJ-92较低。

发酵24小时所有菌株发酵组乳酸产量均显著高于对照组(P<0.05),72小时乙酸含量显著低于对照组(P<0.05),但在发酵72小时FJ-38和FJ-92菌株处理组乳酸产量较高,显著高于其他处理组(P<0.05),所有菌株发酵组乳酸产量均显著高于对照组(P<0.05);FJ-67菌株虽然在之前的产酸性能测定上表现出了较强的产乳酸能力,但在饲料发酵试验中其产酸能力低于其他菌株发酵组;在发酵24小时和72小时,所有菌株发酵组乳酸菌数量均显著高于对照组(P<0.05),其中FJ-38和FJ-92在发酵72小时乳酸菌数量均超过1x109cfu/mL。

3讨 论

发酵饲料是在饲料中接种不同的菌种在适当的温度下自然发酵而成的饲料,不同的接种物对发酵饲料的性质有很大影响,本研究旨在筛选适合家禽发酵饲料的接种菌株。由于高的乳酸浓度和低的pH值是发酵饲料发挥抑菌特性的重要原因,因此本试验首先对分离到的乳酸菌菌株进行了产酸能力分析,然后才进行了抑菌试验和耐酸、耐胆盐试验。在本试验中利用5株筛选到的菌株进行饲料发酵试验,但所有乳酸菌发酵饲料乳酸含量均未能达到150mmol/L。但有研究结果表明,为有效降低病原菌浓度(大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌),发酵饲料中乳酸的浓度必须大于100mmol/L,本试验中有4株乳酸菌达到此要求,其中FJ-38和FJ-92菌株最接近乳酸浓度150mmol/L的要求。但在发酵试验中,不同的饲料组成或料水比可能都会影响到最终发酵饲料的乳酸浓度,因此100mmol/L乳酸浓度作为评判发酵饲料优劣可能更优于150mmol/L。乙醇的产生会引起发酵饲料异味或干物质的损失,但本试验考虑到家禽味觉系统不发达,因此未对该指标进行测定分析。

虽然本试验分离到的部分菌株产酸能力很强,但其是否能在家禽消化道发挥一定的益生特性有待研究。益生菌菌株应具备良好的酸和胆盐耐受力,并对肠上皮细胞具有良好的黏附特性。因此,本试验还测定了候选菌株的耐酸(pH值=2.5)、耐胆盐(2%牛胆汁)和表面疏水性,表面疏水性与益生菌黏附肠上皮细胞能力呈现明显的正相关,结果发现,有5株菌株(FJ-38、FJ-54、FJ-67、FJ-85和FJ-92)表现出了良好的益生特性。结合饲料发酵的结果发现,FJ-38和FJ-92无论从发酵效果和益生特性上在所有候选菌株中表现效果均最好。

虽然本试验发现2株可能作为肉鸡发酵饲料的候选菌株,但其在使用前还需要进一步深入研究。首先要进行耐药性检测,因为目前研究发现,乳酸菌同样能通过水平基因转移引发耐药基因的传播,带来潜在风险;其次,优化料水比并进行大规模发酵试验,进一步确定其在生产中的使用效果;最后,还要进一步验证其在低温环境下的发酵效果,因为很多养殖场缺乏必要的加热设备,在自然环境温度的作用下其发酵效果可能会出现差异。

4结 论

本研究以散养鸡为研究对象,从其肠道中筛选出2株适合作为肉鸡发酵饲料的菌株(FJ-38和FJ-92),这2株菌株具有良好的发酵效果和益生特性,经过分子生物学鉴定发现,FJ-38菌株为植物乳酸杆菌,FJ-92为唾液乳酸杆菌,但其在使用前还需要进一步研究。


相关链接:超强乳酸菌——动物肠道的硬化剂,动物肠道问题的健康保障

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